【图】肺炎衣原体鉴定及检测方法 环境与污染是产生源

根据遗传性和生物学特性， 肺炎衣原体可分为 TWAR、 考拉和马 3 个生物变种。人类肺炎衣原体感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。

根据遗传性和生物学特性， 肺炎衣原体可分为 TWAR、 考拉和马 3 个生物变种。 代表株为 TW-183T（ ATCC VR 2282T）。 TWAR 是由第一次分离到的 2 株 TW-183 和 AR-39的名字合并而成。 TWAR 生物变种仅是从人分离到，同时也只有 1 个血清变种。 TWAR 对呼吸系统有致病性，最突出的是引起急性或慢性支气管炎和肺炎。 此外， 还与急性或慢性呼吸道疾病如中耳炎、 肺阻塞性疾病以及动脉粥样硬化、 哮喘、 结节性红斑、 反应性呼吸道疾病、 Reiter 氏综合征、 肉样瘤病等有关。 参考株是 TW-183T。 肺炎嗜性衣原体考拉生物变种其 MOMP 属于 1 型， 与 TWAR 蛋白同源性为 97.8%， 与马生物变种 MOMP 同源性为94.5%，而与其他衣原体的 MOMP 同源性低于 70%。 参考株为 LPCon。 目 前， 肺炎嗜性衣原体马生物变种只有一个分离株 N16，是 1990 年 Wills 等从马呼吸系统分离到的。其MOMP 与肺炎嗜性衣原体其他株的差异性为 5.5%； 而与衣原体其他种的差异性则>30%。用 N16 分离株接种马可引起无症状感染， 参考株为 N16。

鉴定及检测方法
临床依据患者的症状和体征，很难鉴别细菌性、病毒性、肺炎支原体或肺炎衣原体的感染，以致在临床用药上存在困难，一般只能依赖实验室通过人体体液标本进行病因检测。碘染色法和姬姆萨染色法不适用于Cpn的检测。细胞免疫组织化学法对组织切片进行生物素-抗生物素-过氧化物酶系统着色（又称ABC法）。在冠状动脉硬化斑块上可检出Cpn-EB，透射电镜证明在AS泡沫细胞内有特征性的0.4μm大小的EB。该系统设备价格高昂，技术要求高，只限于科研应用。故不适合直接涂片。
目前常用的检测方法有如下几种：
分离培养
分离培养是Cpn特异性实验室诊断方法，可用鼻咽或喉拭子、痰和胸腔积液标本分离Cpn，鼻咽部拭子是进行分离的理想标本，喉和痰液分离Cpn有何差别还不清楚。Cpn需要在组织中进行培养，无细胞培养基不适合Cpn繁殖，Cpn能在呼吸道来源的细胞系如：HEp-2和HL细胞系中稳定生长。拭子采用涤棉、金属线为好，拭子既应注意防污染，亦要防止细胞和Cpn受抑制，取得的标本通常置于加抗生素和小牛血清的蔗糖磷酸缓冲液（保存于4℃，不超过24h），标本置于室温会降低其活性，如果不能在24h内处理，标本应置于?70℃冰箱保存。接种后72h，要证实菌株，可用Cpn特异性或衣原体种特异性（即抗LPS）荧光结合单克隆抗体进行染色。Cpn包涵体不包含糖原，因此不被碘染色。
但是，肺炎衣原体的组织培养较其他衣原体困难，在作分离培养时，常采取以下措施以增强肺炎衣原体的感染性及促进其在细胞中的生长：①接种物离心（3000r/min）。②培养细胞用30μg/ml的二乙氨基乙基葡聚糖（DEAE-dextran）预处理。③加入细胞生长抑制剂，如环己酞亚胺1μg/ml以抑制宿主细胞生长。Kuo等在研究肺炎衣原体培养所需氨基酸时发现，赖氨酸和蛋氨酸的部分或完全缺失可不同程度地促进肺炎衣原体的生长，但该促进作用在加入环己酞亚胺后变得不明显。Theunissen等观察了SPG保存液的pH、离子强度、温度对肺炎衣原体感染HL细胞的影响，发现pH大于8或小于5，原体的存活率迅速减低；在含10%小牛血清的SPG中，外加NaCI浓度小于80mmol/L时原体的活性受到影响，而0.346～4mmol/L的Ca2+或0～2.5mmol/L的Mg2+对原体感染性的影响不明显；在0～20℃24h内，SPG中原体95%以上存活，温度超过20℃，原体的存活率随存放时间的延长下降迅速[1]  。
血清学检测
最常用的血清学方法是补体结合反应。一般用加热处理过的衣原体悬浮液作为抗原（属特异抗原）来测定被检血清（属特异血清）。哺乳动物和禽类一般于感染后7d、10d出现补体结合抗体。通常采取急性和恢复期双份血清，如抗体滴度增高4倍以上，认为系阳性。关于血清学普查判定标准，国内暂定1∶16或以上为阳性，1∶8为可疑，1∶4以下为阴性。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA已用于痰标本的Cpn抗原检测。优点为特异性强、操作简便、易于自动化，并且可用于大批量标本的检测，另外，快速试验过程仅需1h，临界值易判断，由于可检测血清中IgM和IgG，故能区分急性感染和既往感染，适合于临床实验室作为Cpn感染的常规检查；缺点为敏感性差，阳性预期值较低，不适合人群的筛查。
微量免疫荧光抗体检测（MIF）
MIF技术对肺炎衣原体的诊断是特异的且敏感性高，因此被国内外学者誉为Cpn感染诊断的“金标准”。MIF抗体包括3种：IgM、IgG和IgA。初次感染（原发感染）时，IgM于发病后3周出现，IgG于发病后6～8周出现，而IgA反应较弱或不出现；再次感染（重复感染）时，IgG常在1～2周内出现，且效价可以很高，但往往没有IgM出现或其效价很低。目前诊断标准为：①急性感染：双份血清抗体效价升高4倍以上或IgM=1∶16或IgG≥1∶512；②既往感染：IgM<1∶16且1∶16≤IgG<1∶512；③未感染过∶IgG1∶8。总之，MIF试验是经典的国际通用的方法，对Cpn的诊断具有高度的特异性。但该方法的抗原片制作过程复杂，实验室要求条件高。
无论采用何种检测方法，急性期及恢复期的双份血清标本中，肺炎支原体特异性抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，均可确诊为肺炎支原体感染，这是目前国际上公认的标准。
分子生物学检测用分子生物学方法检测血管组织中Cpn，结果取决于样本收集和操作、引物设计、核酸抽提、扩增物的检测以及假阳性、假阴性结果的预防与鉴别等环节。最常用的引物是omp1、16SrRNA、3SrRNA、Cpn特异性克隆PstI片断等，测定扩增产物多应用琼脂糖电泳、Southernblot、EIA、聚丙烯酰胺胶电泳等。目前分子诊断技术中已有聚合酶链反应（PCR）、套式聚合酶链反应（nPCR）、连接酶链反应（LCR）、转录介导扩增试验（TMA）、基因探针杂交等方法。作为分子生物学方法，PCR法具有快速、简便、灵敏的特点，是Cpn诊断的发展方向。总之，分子生物学方法具有快速、简便、灵敏的优点，是Cpn感染诊断的重要手段。很多学者建议将各种分子生物学方法之间或与其他诊断方法联合应用，并且证明了联合应用能提高Cpn感染诊断的敏感性。如PCR与ELISA联合应用的方法诊断Cpn感染的敏感性高于免疫荧光法、传统PCR法以及ELISA法。此外，其中基因探针杂交和LCR单独使用灵敏度不足，宜与PCR联合应用。nPCR不仅特异性与灵敏度颇占优势，而且由于无须增添任何设备，能开展PCR检测的单位均可实施，是较为适合国情的方法。

环境与污染源
人类肺炎衣原体感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。人类肺炎衣原体感染一年四季均可能发生，不呈季节性特征，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所。
一般认为肺炎衣原体感染与鸟类及其他动物无关，人类是Cpn唯一储存宿主。其传播源是患病者或无症状携带者的呼吸道分泌物和飞沫。另外肺炎衣原体在硬塑料表面能存活30h，在纸巾上能存活12h，在手上存活时间仅10～15min。健康者也可能通过接触这些带有病原体的物体而被感染。
虽然在人肺部感染Cpn的潜伏期约为10d，65d内即可诱导产生特异性T细胞免疫和B细胞免疫，从患者血清中可检测到特异性抗体。这些感染性抗体可暂时地提供一定的机体免疫保护作用。但其免疫力不强，且维持时间短，多数情况下不能阻断再度感染而呈反复发作的状态。
健康人群可分离出Cpn，提示存在健康的带菌者或隐性感染者。然而正是这些无症状的“健康”或“亚健康”的携带者在传播Cpn上具有重要意义